伯樂(lè)CFX DUET實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的操作使用方法。這是一款非常經(jīng)典和用戶(hù)友好的qPCR儀器，其操作流程主要分為實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、軟件設(shè)置、運(yùn)行儀器和數(shù)據(jù)分析四個(gè)部分。

一、伯樂(lè)CFX DUET實(shí)時(shí)熒光定量pCR儀軟件設(shè)置 - 創(chuàng)建并運(yùn)行一個(gè)實(shí)驗(yàn)

在CFX Maestro軟件主界面，點(diǎn)擊 “新建實(shí)驗(yàn)"。

1、步驟1：設(shè)置實(shí)驗(yàn)類(lèi)型和檢測(cè)染料

（1）實(shí)驗(yàn)類(lèi)型：選擇 “定量PCR"。

（2）檢測(cè)模式：

探針?lè)ǎ喝绻褂昧薚aqMan探針等，選擇 FAM 或其他對(duì)應(yīng)熒光基團(tuán)。

染料法：如果您使用了SYBR Green I等染料，選擇 SYBR。

您也可以在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置多種檢測(cè)模式（例如，一部分孔用FAM，另一部分用HEX/VIC/JOE），這就是“DUET"名稱(chēng)的由來(lái)，支持雙色檢測(cè)。

2、步驟2：設(shè)置板布局

軟件界面會(huì)顯示一個(gè)虛擬的96孔板圖。

（1）指定樣品類(lèi)型：

未知樣品：您的待測(cè)樣本。

陽(yáng)性對(duì)照：已知含有目標(biāo)序列的樣品。

陰性對(duì)照：不含模板的樣品（如用水代替），用于檢測(cè)是否有污染。

標(biāo)準(zhǔn)品：用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。您需要輸入每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的已知濃度。

（2）指定目標(biāo)基因：為每個(gè)孔或每組孔指定檢測(cè)的基因名稱(chēng)（例如，GeneA， ActB）。

（3）指定熒光染料：為每個(gè)孔或每組孔指定所使用的熒光通道（如FAM， SYBR）。

3、步驟3：設(shè)置反應(yīng)程序

這是qPCR反應(yīng)的核心步驟，通常包括三個(gè)階段：

（1）酶激活步驟（可選，取決于預(yù)混液）：

溫度：95 °C

時(shí)間：2-10 分鐘

循環(huán)數(shù)：1

（2）擴(kuò)增循環(huán)（PCR循環(huán)） - 重復(fù)運(yùn)行40-45個(gè)循環(huán)：

變性：

溫度：95 °C

時(shí)間：10-30 秒

退火/延伸：

溫度：55-65 °C（根據(jù)您的引物TM值優(yōu)化）

時(shí)間：30-60 秒

在此步驟末采集熒光信號(hào)。

（3）熔解曲線(xiàn)分析（僅適用于SYBR Green染料法）：

程序會(huì)自動(dòng)添加。通常是從65°C緩慢升溫到95°C，在此過(guò)程中連續(xù)采集熒光信號(hào)，用于確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

（4）步驟4：開(kāi)始運(yùn)行

檢查所有設(shè)置無(wú)誤后，點(diǎn)擊右上角的 “開(kāi)始運(yùn)行" 按鈕。

系統(tǒng)會(huì)彈出對(duì)話(huà)框，讓您輸入實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)并選擇保存位置。

確認(rèn)后，儀器將開(kāi)始運(yùn)行程序。您可以在軟件界面上實(shí)時(shí)查看反應(yīng)進(jìn)程、熒光信號(hào)增長(zhǎng)曲線(xiàn)和溫度變化。

二、伯樂(lè)CFX DUET實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀運(yùn)行后數(shù)據(jù)分析

1、查看擴(kuò)增曲線(xiàn)：

軟件會(huì)自動(dòng)設(shè)置基線(xiàn)閾值和Ct值。您可以檢查擴(kuò)增曲線(xiàn)是否平滑，S形曲線(xiàn)是否典型。

2、查看熔解曲線(xiàn)（僅SYBR Green法）：

確認(rèn)每個(gè)樣品只有一個(gè)單一的尖峰。如果出現(xiàn)多個(gè)峰，可能意味著有引物二聚體或非特異性擴(kuò)增。

3、結(jié)果分析：

相對(duì)定量（常用方法）：使用 ΔΔCt法 計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。您需要指定內(nèi)參基因和對(duì)照組。

定量：如果您使用了標(biāo)準(zhǔn)品，軟件會(huì)自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并根據(jù)曲線(xiàn)計(jì)算出每個(gè)未知樣品的絕對(duì)拷貝數(shù)或濃度。

4、導(dǎo)出數(shù)據(jù)：您可以將結(jié)果（包括圖表和數(shù)據(jù)表格）導(dǎo)出為PDF或Excel文件，用于報(bào)告和進(jìn)一步處理。

三、重要注意事項(xiàng)與日常維護(hù)

1、安全重要性：在運(yùn)行前確保板子或管子已密封，防止生物污染。

2、保持清潔：定期用蘸有70%乙醇的無(wú)塵紙擦拭樣品槽的表面，防止灰塵或污染物影響光學(xué)系統(tǒng)。

3、避免強(qiáng)光直射：將儀器放置在穩(wěn)定、無(wú)振動(dòng)、遠(yuǎn)離強(qiáng)光源和磁場(chǎng)的地方。

4、軟件熟悉：花些時(shí)間熟悉CFX Maestro軟件的各個(gè)功能，它非常強(qiáng)大且直觀(guān)。

5、預(yù)混液說(shuō)明書(shū)：不同廠(chǎng)家的qPCR預(yù)混液推薦的反應(yīng)程序可能略有不同，請(qǐng)以您所用試劑的說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)進(jìn)行微調(diào)。

開(kāi)機(jī) → 打開(kāi)CFX Maestro → 新建實(shí)驗(yàn) → 設(shè)置檢測(cè)染料 → 設(shè)置板布局（指定樣品、基因）→ 設(shè)置反應(yīng)程序（激活、變性、退火/延伸、熔解曲線(xiàn)）→ 保存并開(kāi)始運(yùn)行 → 分析數(shù)據(jù)（擴(kuò)增曲線(xiàn)、熔解曲線(xiàn)、定量）→ 導(dǎo)出報(bào)告