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五種熒光PCR試劑染料原理是什么?

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以下是幾種常見用于熒光 PCR 試劑的染料及其原理:


一、SYBR Green I

原理:SYBR Green I 是一種能與雙鏈 DNA 小溝特異性結(jié)合的熒光染料。在游離狀態(tài)下,它的熒光信號相對較弱,而當(dāng) PCR 反應(yīng)進(jìn)行,隨著引物延伸,新的雙鏈 DNA 不斷合成,SYBR Green I 就會結(jié)合到雙鏈 DNA 上,熒光強(qiáng)度會大大增強(qiáng),通過檢測熒光信號的變化就能實(shí)時監(jiān)測 PCR 產(chǎn)物量的增加情況。其激發(fā)波長通常在 497nm 左右,發(fā)射波長在 520nm 左右呈現(xiàn)綠色熒光。不過,它的缺點(diǎn)是特異性稍差,因?yàn)橹灰请p鏈 DNA 它都會結(jié)合并產(chǎn)生熒光信號,所以可能會受到引物二聚體等非特異性雙鏈 DNA 的干擾,在結(jié)果分析時需要通過熔解曲線分析等手段進(jìn)一步區(qū)分特異產(chǎn)物和非特異產(chǎn)物。


二、TaqMan 探針

原理:TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針,其 5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)(比如 FAM 等常見熒光基團(tuán)),3’端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)(如 TAMRA 等)。在完整的探針狀態(tài)下,由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效應(yīng),報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光會被淬滅熒光基團(tuán)吸收,使得檢測不到報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光信號。當(dāng) PCR 反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段,Taq DNA 聚合酶具有 5’→3’外切酶活性,會沿著模板鏈合成新鏈的同時,將與模板鏈互補(bǔ)結(jié)合的 TaqMan 探針從 5’端逐步水解切斷,使得報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,F(xiàn)RET 效應(yīng)消失,報(bào)告熒光基團(tuán)就能發(fā)出熒光,熒光信號強(qiáng)度就會隨著 PCR 循環(huán)次數(shù)增加而增強(qiáng),從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo) DNA 序列擴(kuò)增的實(shí)時監(jiān)測。


三、分子信標(biāo)(Molecular Beacon)

原理:分子信標(biāo)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針,其環(huán)狀部分是與目標(biāo) DNA 序列互補(bǔ)的識別序列,兩端的臂部序列互補(bǔ)配對形成莖干結(jié)構(gòu)。在自由狀態(tài)下,由于兩端的熒光基團(tuán)(5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán),如 FAM 等,3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán),如 DABCYL 等)距離很近,同樣基于 FRET 效應(yīng),報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光被淬滅。當(dāng) PCR 反應(yīng)體系中有目標(biāo) DNA 存在時,分子信標(biāo)會與目標(biāo) DNA 序列特異性結(jié)合,莖干結(jié)構(gòu)打開,熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離,報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光得以釋放,通過檢測熒光信號變化來反映目標(biāo) DNA 的有無及含量變化,并且其特異性高,對單堿基錯配也有較好的識別能力。


四、蝎形引物(Scorpion Primer)

原理:蝎形引物由一個常規(guī)引物和一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針部分組成,發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)部是與 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物特異性互補(bǔ)的序列,其 5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán),3’端連接有淬滅熒光基團(tuán),且在莖干部分還有一段能與引物延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的序列。在 PCR 反應(yīng)初期,引物參與延伸反應(yīng)合成新鏈,當(dāng)新鏈合成到一定程度后,蝎形引物的探針部分會與新合成鏈中的互補(bǔ)序列結(jié)合,形成分子內(nèi)雜交,使得發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開,熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離,熒光信號產(chǎn)生并隨著 PCR 循環(huán)次數(shù)增多而增強(qiáng),從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo) DNA 的實(shí)時檢測,這種方式將引物和探針功能結(jié)合,有助于提高檢測的特異性和靈敏度。


五、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)雜交探針

原理:通常使用兩條寡核苷酸探針,一條探針的 5’端標(biāo)記有供體熒光基團(tuán)(如 fluorescein 等),另一條探針的 3’端標(biāo)記有受體熒光基團(tuán)(如 Cy5 等)。在溶液中,兩條探針分別獨(dú)立存在時,供體熒光基團(tuán)在激發(fā)光激發(fā)下發(fā)出的熒光能被檢測到。當(dāng)兩條探針同時與目標(biāo) DNA 序列特異性結(jié)合,且兩條探針之間的距離合適(一般在 10 - 100 ? 之間)時,就會發(fā)生 FRET 現(xiàn)象,供體熒光基團(tuán)將能量傳遞給受體熒光基團(tuán),使得受體熒光基團(tuán)發(fā)出特征性熒光,通過檢測受體熒光基團(tuán)的熒光信號變化來對目標(biāo) DNA 進(jìn)行定性和定量分析,這種方法特異性也較好,對檢測復(fù)雜樣本中的目標(biāo)序列有優(yōu)勢。


不同的熒光染料或探針有著各自的特點(diǎn)和適用場景,在實(shí)際的熒光 PCR 實(shí)驗(yàn)中可以根據(jù)具體需求來選擇應(yīng)用。

TEL:18016231680

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